利用发光细菌检验水中有毒有害物质
摘要：水源污染引发了一系列的问题，首先是水质检验，特别是水中有毒有害物质的检验问题，水中有毒有害物质可以通过各种水质分析方法予以检出，然后对之进行对健康的综合评价，检测水中有毒有害物，有时采用生物方法，如鱼毒理学生物检验，水蚤试验等；也有采用近代遗传毒理学的方法，如Ames致突变试验[1]，姐妹染色体交换试验等等，则可提供水质对健康影响的信息，本文则介绍利用发光细菌检验水中有毒有害物质的基本原理，检验方法和评价标准。 关键词：水质检验 发光细菌 有毒有害物质 一、发光细菌的存在，分离，纯化和培养[2] 广阔的海洋是发光细菌生活的大本营，从近海沿岸到南北极；从海水表面到深达1000米的海底都可找到发光细菌，只有少数生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各种海洋动物如海鱼的发光器官中；有的独立生活在海水中，其数量依外界条件的变化而异，据测定夏秋季的海水中每毫升多达几十到几百个，发光细菌属于肠道菌属，分为十个种四个属，在我国海洋中也陆续分离到十个种的六种，其中包括我国特有的新种。发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离，所采用的培养基为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，琼脂2%，pH6.5。高压灭菌后制成平板，将海鱼或无脊椎动物（如乌贼）切成3～4cm大小小块，或取其内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12－18小时，在暗室中寻发光点，用接种环挑取发光点，在营养平板上，线培养后形成单个发光菌，再挑取单菌落反复划线分离几次，即可得到纯化的发光菌株，将纯化的菌株接种入同样成分的斜面培养基上，经培养12小时后，在4℃下保存，每月转接一次，可长期保存活力，使用前接种到液体培养基中20℃下振荡培养10－12小时，用磷酸缓冲液稀释后备用。国内外一般都用明亮发光杆菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的检验，上海华东师范大学已将此菌种制成干燥粉剂-20℃下可长期保存，使用极为方便。 二、发光菌的发光机理 微生物在氧化代谢或呼吸作用过程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好气性细菌具有细胞色素氧化还原酶系统，由于好气性细菌的细胞色素可以作为氢的最终受体而利用空气中的氧，底物的氢传递到NAD（烟酰胺腺嘌呤核苷酸）的脱氢酶的辅基上，结果形成还原型的AAD-H2，它可以将氢传递给黄素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者转化为FAD- H2，就可以传递给细胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式释放。发光细菌的发光过程是一种光呼吸过程，是上述电子传递链上的一个侧支[2]，还原型的黄素单核苷酸，FMNH2充当反应的底物，萤光酶起催化作用，长链脂肪醛起作改变萤光酶构造的“修饰”作用。萤光酶通过分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，这种氧化还原反应结果便产生磷光(465～490nm之间较多)。外界条件和培养基成分pH，温度，氧浓度变化会影响细菌的发光，而有毒的化学物质，重金属离子，抗生素，化学治疗剂，农药等同样会影响细菌发光，故采用发光细菌作为敏感的指标物测定有毒有害物是可能的。 三、发光细菌检测有毒有害的方法[3] 1.仪器：SHG-1型生物化学发光测量仪（上海市技术监督局实验工厂产品）或Microtox 2055型毒物分析系统（美国MICROBICS CORPORATION产品）2.培养基(1)液体培养基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，3g，蒸馏水1000ml，pH6.5。(2)固体培养基：上述液体培养基成份加2%琼脂即可。(3)稀释用磷酸缓冲液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，NaCI30g，蒸馏水100ml，pH6.5。3.水样浓缩作某化学物质的试验只需配制一定浓度的溶液即可，进行水样中有毒有害物质的试验则需事先进行水样中毒害物的吸附，洗脱和浓缩。取一定体积水样V升（视水质而定），用大孔树脂(XAD系列事先分别经甲醇、乙腈、丙酮回流8小时后保存于甲醇中)，用重蒸洗脱，浓缩至残渣，用1ml重蒸过的二甲亚砜溶解之。1ml≈1V升水样0.1ml≈0.1V升水样4.测定步骤(1)菌体活化：装置为0.5ml干燥菌剂，开封后注入2～3ml冷的稀释液，在旋转混合器上振荡2～3分钟，20℃平衡5～10分钟，使其活化，待发光稳定后即为活化菌悬浮液，置4℃下备用（活化后一天可用）。(2)菌液处理：吸取不同体积（视水质而定）二甲亚砜水样浓缩液，分别在试管中用无菌蒸馏水稀至1ml，加入1ml缓冲液，然后再加入0.1ml菌悬浮液，摇匀，在一定温度下(20±1℃)反应10分钟。并同时以二甲亚砜作对照试验。(3)用SAG-1型发光测量仪测定光强度。(4)活菌计数在测定光强度的同时用上述加有菌悬浮液的稀释液稀释涂布营养平板，23℃培养12～16小时，计算活菌数。(5)结果计算：相对抑光率=对照管光强－样品管光强／对照管光强×100％细菌死亡率=对照活菌数－样品组活菌数／对照组合菌数×100％对于单一化学物质当达到抑光率为50%时的浓度用EC50表示，目前已有大量的有机物测得了其EC50值[4]。对于水样试验结果只能用水样体积表示，EV50即表示抑光率为50%时所相对应的水样体积。5.试验结果的评价标准对于某个水样品可根据EC50评价其毒性的有无，按照25%的准则，当某个水样品的EC50≦25%时可记为有毒，按50%准则，某个水样的EC50≦50%可记为有毒[5]，还有一些分级方法。如何用发光细菌的检验结果来评价水质进行分类是一个有待研究的问题，目前只能用以在相同条件下比较不同水样的毒性，即加入同一水样体积后测定其抑光率，抑光率大小评价其毒性；或者测得其EV50，依EV50的大小评价其毒性。
